Filetype PDF | Posted on 14 Sep 2022 | 4 years ago
Authentication
digital resources
338x Filetype PDF File size 0.08 MB Source: inis.iaea.org
Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi Nuklir Tema : Peningkatan Peran Iptek Nuklir
PTNBR – BATAN Bandung, 3 Juni 2009 untuk Kesejahteraan Masyarakat
OPTIMASI PEMISAHAN FASE CAIR
PADA KIT RADIOIMMUNOASSAY AFLATOKSIN B1
1 1 1 1 1
Agus Ariyanto , Martalena Ramli , Fitri Yunita , Gina Mondrida , Sutari ,
1 1
Sri Setiowati dan Triningsih
1
Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN, Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang
Email: danto@batan.go.id
ABSTRAK
OPTIMASI PEMISAHAN FASE CAIR PADA KIT RADIOIMMUNOASSAY AFLATOKSIN
B1. Aflatoksin adalah metabolit sekunder dari jamur Aspergillus flavus dan A. parasiticus yang tumbuh
pada berbagai jenis bahan pangan dan pakan serta produknya. Aflatoksin khususnya aflatoksin B1
mempunyai aktivitas biologi yang luas diantaranya toksik, teratogenik, mutagenik dan karsinogenik.
Oleh karena itu kandungan aflatoksin dalam makanan harus memenuhi tingkat keamanannya. Metode
yang sensitif, spesifik, akurat, dan praktis untuk deteksi aflatoksin adalah metode imunokimia atau
immunoassay, diantaranya adalah teknik radioimmunoassay (RIA). Teknik ini didasarkan pada prinsip
125
imunologi menggunakan perunut radioaktif. Aflatoksin B1 (AfB ) ditandai dengan I secara tidak
1
langsung kemudian dimurnikan dengan metode ekstraksi pelarut. Perunut selanjutnya diuji aktivitas
imunologinya menggunakan poliklonal antibodi aflatoksin B1. Untuk menghasilkan kit RIA Af yang
B1
memenuhi baku mutu yang disyaratkan, ada dua hal yang perlu dioptimasi. Yang pertama adalah
125
optimasi komponen kit yang terdiri standar AfB , perunut AfB (AfB bertanda I) dan antibodi AfB .
1 1 1 125 1
Hal kedua yang harus dioptimasi adalah metode pemisahan antara kompleks I-AfB -Ab- AfB dari
125 125 1 1
fraksi I- AfB bebas ( I- AfB yang tidak bereaksi). Pemisahan antara AfB1 yang terikat dan fraksi
1 1
bebas dilakukan dengan metode pengendapan menggunakan campuran polietilenglikol (PEG), antibodi
kedua dan serum kelinci normal (NRS). Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan komposisi
pereaksi pemisah yang optimal pada metode pemisahan fase cair kit RIA aflatoksin B . Pembuatan
125 1
AfB1 bertanda I menghasilkan rendemen rata-rata 53,7± 10,15 % %, ikatan imunologi 30,6 % dan
ikatan tak spesifik sebesar 3,0 % serta perunut tersebut stabil selama 2 minggu. Dari optimasi metode
pemisahan fasa cair menggunakan campuran PEG dan serum kelinci normal (NRS) , didapatkan bahwa
penggunaan pereaksi pemisah PEG sebesar 18 % yang dicampurkan dengan NRS 7,5 % dapat
125
memberikan hasil pemisahan yang optimal untuk memisahkan antara kompleks I- AfB -Ab- AfB dan
125 1 1
fraksi I- AfB bebas dengan % ikatan imunologi (%B/T) sebesar 20,3 % dan ikatan tak spesifik
1
(%NSB) 1,7 %. Diketahui juga bahwa penggunaan antibodi kedua pada pemisahan antara kompleks
125 125
I- AfB -Ab- AfB dan fraksi I- AfB bebas dapat meningkatkan ikatan imunologi (% B/T)
1 1 1
125
Kata kunci. (RIA), Aflatoksin B1, karsinogenik,RIA, optimasi, kompleks I - AfB -Ab - AfB
1 1
ABSTRACT
OPTIMISATION OF LIQUID FASE SEPARATION ON AN AFLATOXIN B1
RADIOIMMUNOASSAY KIT. Aflatoxins are secondary metabolites of Aspergillus flavus and A.
parasiticus, which grow on a wide variety of food, feeds and their products. Aflatoxin, particularly
aflatoxin B1 (AfB1) has wide biological activities including toxic, teratogenic, mutagenic and
carcinogenic. Therefore the Af contentin foods should be met the requirement of food safety standard.
B1
Radioimmunoassay (RIA) technique is one of immunochemical methods or immunoassays which has
been considered to be sensitive, specific, accurate and practical for detection of aflatoxin. This
technique is based on immunological reaction using radioactive tracer. AfB1 was indirectly
radiolabelled and then purified by using a solvent extraction. The tracer was then undergone a
immunological testing by using a polyclonal antibody of AfB . In order to produce Af RIA kit which
1 B1
meets the standard quality’s requirement there are two parameters that have to be optimised. First is
125
optimisation of kit components which consist : standar AfB , AfB tracer ( I-AfB ) and AfB antibody.
1 1 1 1
299
Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi Nuklir Tema : Peningkatan Peran Iptek Nuklir
PTNBR – BATAN Bandung, 3 Juni 2009 untuk Kesejahteraan Masyarakat
125 125
Second parameter is optimisation of separation method of I-AfB -Ab-AfB complex from free I-AfB
125 1 1 1
( I-AfB which does not react with Ab-AfB ). The separation of the bound Af from free fraction was
1 1 B1
carried out using precipation method where a mixture of polyethylen glykol (PEG), second antibody and
normal rabbit serum (NRS) was used as precipatating agent. The aim of this study was to get the
125
optimum composition of agent for separation liquid fase of Af RIA kit. Preparation of I-AfB
B1 1
resulted an average of yield of 53.7± 10,15 % %, immunological binding of 30.6 % and non specific
binding of 3,0 %. Optimisation of precipitating agent which was carried out using a mixture of 18 %
125
PEG and 7.5 % NRS was found to give an optimal separation between I- AfB -Ab- AfB complex from
125 1 1
free I-AfB1which has given a percentage of immunological binding of 20.3% and a non specific
125
binding of 1.7%. It was also found out that the addition of second antibody in separation of I- AfB -
125 1
Ab- AfB1 complex from free I-AfB1 was also found to be be able in improving the percentage of
immunological binding (% B/T)
125
Key word: Aflatoxin B , carcinogenic, RIA, optimisation, I-AfB -Ab-AfB complex.
1 1 1
1. PENDAHULUAN digunakan untuk kuantifikasi berbagai zat atau
analit adalah teknik radioimmunoassay (RIA).
Aflatoxin merupakan kelompok racun yang Teknik ini merupakan teknik analisis yang
banyak dihasilkan dari metabolisme sekunder didasarkan pada prinsip imunologi yang
dari beberapa strain jamur Aspergillus flavus menggunakan perunut radioaktif. Teknik ini
dan semua strain Aspergillus parasiticus. spesifik karena didasarkan pada reaksi
Aflatoksin khususnya aflatoksin B1 (AfB ) imunologi antara antigen dan antibodi yang
1
mempunyai aktivitas biologi yang luas spesifik hanya untuk antigen tertentu saja. Oleh
diantaranya toksik, teratogenik, mutagenik dan karena teknik RIA ini sangat spesifik maka zat-
karsinogenik. International Agency for Research zat yang ada dalam cuplikan dapat langsung
on Cancer (IARC) menetapkan AfB sebagai dianalisis tanpa perlu dipisahkan dari matriks
1
karsinogen potensial. Oleh karena itu kandungan yang kompleks. Penggunaan zat radioaktif
aflatoksin pada makanan tidak boleh melebihi menyebabkan teknik ini sangat peka, karena
tingkat keamanannya [1]. Menurut Food & radioaktivitas perunut dapat diukur dengan
Drug Administration (FDA) batas maksimum peralatan yang sangat peka. Analisis aflatoksin
kadar aflatoksin yang masih diperbolehkan menggunakan teknik RIA dilaporkan mampu
dalam bahan makanan adalah 20 ppb. WHO medeteksi kadar AFB dalam pangan dan pakan
1
memberikan batas yang lebih rendah yaitu 5 yang kadarnya relatif rendah (0,5-300 ng/g) [4].
ppm untuk kandungan aflatoksin B1 untuk Untuk menghasilkan kit RIA AfB yang
1
semua produk makanan, sedangkan kandungan memenuhi baku mutu yang disyaratkan ada dua
total aflatoksin tidak boleh lebih dari 10 ppm hal yang perlu dioptimasi. Yang pertama adalah
[2]. optimasi komponen kit yang terdiri standar
Selama ini ada dua metode standar deteksi AfB , perunut AfB (AfB yang ditandai dengan
1 125 1 1
AfB yang umum digunakan, yaitu kromatografi radionuklida I) dan antibodi AfB . Perunut
1 125 1
cair kinerja tinggi (KCKT) dan kromatografi AfB (I-AfB) harus mempunyai
1 1
lapis tipis (KLT). Kedua metode tersebut sangat immunoreaktivitas antara 50 – 60%. Sementara
akurat tetapi metode ini memerlukan waktu itu antibodi AfB (Ab AfB ) yang diproduksi
1 1
preparasi cuplikan yang mahal dan lama. Untuk juga harus bereaksi secara spesifik hanya
125
itu perlu dikembangkan satu metode yang tidak dengan AfB dan perunut AfB ( I-AfB ). Hal
1 1 1
hanya mempunyai akurasi dan ketelitian yang kedua yang harus dioptimasi adalah metode
125
tinggi, spesifik dan peka tetapi pengerjaannya pemisahan antara kompleks I- AfB -Ab- AfB
125 125 1 1
juga sederhana dan sekaligus mampu dari fraksi I- AfB bebas ( I- AfB yang
menganalisis beberapa cuplikan dalam satu set tidak bereaksi) [5]. 1 1
analisis. Teknik analisis yang dapat Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
dikembangkan untuk mengantikan dua metode mendapatkan parameter pemisahan fase cair
konvensional di atas adalah metode imunokimia yang optimal pada kit RIA AfB sehingga dapat
1
[3]. dikembangkan Kit RIA AfB yang dapat
1
Salah satu metode imunokimia yang banyak memenuhi baku mutu, yaitu kit yang sensitif,
300
Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi Nuklir Tema : Peningkatan Peran Iptek Nuklir
PTNBR – BATAN Bandung, 3 Juni 2009 untuk Kesejahteraan Masyarakat
spesifik, dan akurat untuk analisis AFB1. CMO yang sudah diaktifasi.
Diharapkan kit RIA AFB yang akan
1 125
dikembangkan ini dapat digunakan secara luas 2.3.2 Konjugasi AfB1-CMO dengan I-
oleh produsen bahan pangan, makanan jadi histamin
maupun pakan ternak dalam rangka menunjang
penyediaan bahan pangan dan pakan ternak Sebanyak 2 mg AfB1-CMO diaktifasi
yang sehat dan tidak membahayakan kesehatan dengan cara dilarutkan dalam 50 μl dioksan
manusia dan ternak. Selain itu kit ini dapat bebas air lalu ditambah dengan 10 μl
menganalisis cuplikan dengan cepat dan dengan tributilamin yang telah dilarutkan dalam dioksan
biaya yang lebih murah dibandingkan metode (1:5) dan didinginkan sampai 10 °C. Selanjutnya
konvensional KCKT dan KLT campuran ditambah dengan 10 μl
isobutilkloroformat (1:10 dalam dioksan) dan
diinkubasi selama 30 menit pada temperatur
2. BAHAN DAN METODE 10°C dengan pengadukan. Campuran di atas
diencerkan dengan dioksan sampai 2,8 ml,
2.1 Bahan kemudian 50 μl larutan tersebut dimasukkan ke
125
Aflatoxin B1 (Sigma), aflatoxin B1 BSA dalam larutan histamin bertanda I dan diaduk
konjugat (Sigma), asam aminoksi acetat selama 2 jam. Setiap 1 jam pH diperiksa dan pH
(Sigma), piridin (TCI), akuabides (IPHA), campuran tetap dijaga pada pH 8. Selanjutnya
ITLC-SG (Merck), metanol (Merck), CHCL3 hasil konjugasi ini dimurnikan dengan ekstraksi
(Merck), silica gel (Merck), histamin (Sigma), pelarut.
Na-metabisulfit (Sigma), kloramin-T (Sigma) 2.3.3 Pemurnian konjugat AfB1-CMO- 125I -
Na125I (Nordion), dioksan bebas Air (Sigma), histamin
tributilamin (Sigma), isobutilkloroformat
(Sigma), larutan dapar fosfat 0,5 M pH 8, Hasil konjugasi AfB1-O- CMO dengan
larutan dapar fosfat salin 0,05 M pH 7,4 dan 125
polietilen glikol (PEG) Merck. I- histamin diasamkan dengan 1 ml HCl 0,1 N
dan diekstraksi dengan 1 ml etil asetat (ekstrak
2.2 Peralatan I). Fasa air ditambah 1 ml NaOH 0,1 N dan 1 ml
natrium metabisulfit (1 mg/ml) dalam 0,5 M
Timbangan analitik, UV kabinet, UV-Vis dapar fosfat dan selanjutnya dieksraksi lagi
spektrofotometer (Jasco Japan), alat pencacah dengan 0,5 ml etil asetat (ekstrak II). Jumlah
gamma (DPC), sentrifuga (Beckman), plat radioaktifitas yang terdapat pada ekstrak I dan II
pemanas/ pengaduk, termometer. di bagi radioaktifitas awal dikalikan 100%
adalah rendemen penandaan. Ekstrak I dan II
2.3 Pembuatan AfB1-CMO-125I Histamin tidak dicampur karena biasanya tingkat
imunologinya berbeda. Masing-masing ekstrak
125 selanjutnya diperiksa kemurnian radiokimianya
Pembuatan perunut AfB1-CMO- I menggunakan kromatografi lapis tipis silika gel
histamin dilakukan dengan penandaan tidak dengan fase gerak campuran toluen - metanol –
langsung. Penandaan dilakukan dua tahap, asam asetat dengan perbandingan (75:24:1)[5].
125 125
pertama histamin ditandai dengan I kemudian Konjugat AfB1-CMO- I- Histamin untuk
dikonjugasikan dengan AfB1-CMO yang sudah 125
diaktifasi. selanjutnya disebut AFB1 bertanda I dan diuji
stabilitasnya selama dalam penyimpanan.
125
2.3.1 Penandaan histamin dengan I 2.4 Pembuatan larutan pemisah fasa cair
Sejumlah10 µl histamin (22 μg/mL) 125
Pemisahan antara kompleks I- AfB -Ab-
125 125 1
ditambah 20 μl Na I (~ 2 mCi) dan 10 µl AfB dan fraksi I-AfB bebas dilakukan
kloramin-T (5 mg/mL), kemudian campuran 1 1
dengan metode pemisahan fase cair
dikocok dengan pengocok vorteks selama 1 menggunakan polietilen glikol (PEG) sebagai
menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan pengendap. Larutan pemisah fase cair ini terdiri
10 µL larutan Na metabisulfit (30 mg/mL) dan dari campuran PEG, serum kelinci normal
diperiksa rendemen penandaan . Bila rendemen (NRS) dan antibodi kedua. Penggunaan semua
125
histamin bertanda I lebih dari 45%, pereaksi tersebut harus dioptimasi. Tujuan
dilanjutkan dengan konjugasi dengan AfB1- dilakukan optimasi adalah untuk mendapatkan
301
Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi Nuklir Tema : Peningkatan Peran Iptek Nuklir
PTNBR – BATAN Bandung, 3 Juni 2009 untuk Kesejahteraan Masyarakat
jumlah pereaksi yang optimal sehingga imunologinya masih diatas 20% seperti terlihat
memberikan % ikatan imunologi (%B/T) yang pada Gambar 1.
optimal dan % ikatan tak spesifik (%NSB) yang
rendah (<5%). PEG ditimbang masing-masing
sebanyak 10 g, 15 g, 18 g, 20 g lalu dilarutkan i 35
dalam 100 ml dapar fosfat salin 0,05 M pH 7,4 g30
o
l 25
(larutan dapar kerja), sehingga didapatkan o
n
20 %B/T
larutan PEG dengan konsentrasi 10 %, 15 %, 18 u
15
m
I
% dan 20 %. Kedalam masing-masing larutan
n
10
ini ditambahkan NRS dengan variasi konsentrasi e
s 5
r
(2,5 %, 5 %, 7,5 %, 10 % dan 15 % dalam e 0
larutan dapar kerja). Antibodi kedua dengan P
pengenceran 1 : 100. Antibodi kedua adalah
antibodi yang diperoleh dengan cara
menyuntikkan IgG kelinci ketubuh kambing, Waktu
sehingga dalam tubuh kambing terbentuk
antibodi kedua. Gambar 1. Kurva stabilitas perunut AfB1
bertanda 125I pada penyimpanan dalam
2.5 Prosedur assay penentuan ikatan 0
imunologi aflatoksin B refrigerator (4 C).
1
Sebanyak 100 ul larutan blanko dipipet ke Metode pemisahan antara kompleks 125I-
dalam tabung reaksi yang sudah diberi tanda 125
AfB -Ab- AfB dan fraksi I- AfB bebas
sesuai dengan variasi konsentrasi larutan 1 1 1
pereaksi pemisah fase cair yang sudah disiapkan dilakukan dengan metode pemisahan fase cair.
seperti prosedur di atas . Kemudian ditambah Beberapa pereaksi yang perlu dioptimasi
125 penggunaannya meliputi polietilen glikol
dengan 300 ul AfB1 bertanda I dengan (PEG), serum kelinci normal (NRS) dan
jumlah cacahan ± 30.000 cpm dan 100 ul antibodi kedua. PEG merupakan polimer dengan
antibodi AfB1 selanjutnya di inkubasi selama 3 berat molekul yang besar sehingga dapat
jam pada temperatur kamar . Setelah itu 125
mengendapkan kompleks I- AfB -Ab- AfB
ditambahkan 100 ul antibodi kedua dan 1000 ul 1 1.
PEG dengan konsentrasi yang berbeda-beda (10 Dari penelitian ini diketahui bahwa penggunaan
konsentrasi PEG sebesar 18 % dapat
%, 15 %, 18 %, 20 %) yang masing –masing 125
mengendapkan kompleks I- AfB -Ab- AfB
telah mengandung serum kelinci normal dengan 1 1
konsentrasi (2,5 %, 5%, 7,5 %, 10 % dan 15 %), dengan baik yang ditunjukkan oleh ikatan
lalu inkubasi dilanjutkan selama 15 menit dan imunologi diatas 20 % dengan ikatan tak
disentrifugasi selama 20 menit pada 3000 rpm spesifik yang rendah 1,7 % seperti terlihat pada
125 Gambar 2.
untuk memisahkan antara kompleks I- AfB -
125 1
Ab- AfB dan fraksi I- AfB bebas,
1 1
selanjutnya didekantasi dan ditentukan 25
radioaktivitas endapan yang tertinggal didalam
125 20
tabung yaitu kompleks I- AfB -Ab- AfB %
1 1 i NSB
g
l
o
15
n
u
3. HASIL DAN PEMBAHASAN m
i
10
n
e
s
Rata-rata Penandaan AfB1-CMO dengan r
e
5
125I-Histamin didapatkan rendemen penandaan P
53,3 ± 10,15 % dan ikatan imunologi (%B/T) 0
30,6 % dengan ikatan tak spesifik (NSB) 2,97 0 5 10 15 20 25
125 Konsentrasi PEG,%
%. Perunut AfB1 bertanda I ini memenuhi
syarat untuk digunakan karena nilai ikatan tak
spesifiknya masih dibawah 5 % , sehingga dapat Gambar 2. Hubungan antara jumlah PEG
digunakan untuk pengujian optimasi pereaksi- digunakan terhadap Ikatan imunologi (%B/T)
125
pereaksi lainnya. Perunut AfB1 bertanda I ini
juga relatif stabil sampai 3 minggu bila Pada penggunaan serum kelinci normal
disimpan di refrigerator dengan ikatan
302
no reviews yet
Please Login to review.
